Question

下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請(qǐng)分析回答下列問題。

資料1 巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時(shí)AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)[5'AOX1和3'AOX1(TT)分別是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子]。

資料2 巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，可以將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上 、 限制酶識(shí)別序列， 這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用 將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取 。

（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶 來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。

（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因，可以用 方法進(jìn)行檢測(cè)。

（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入 以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)。

（6）與大腸桿菌等細(xì)菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在蛋白質(zhì)合成后，細(xì)胞可以對(duì)其進(jìn)行 并分泌到細(xì)胞外，便于提取。

Answer 1