Question

20．下面是探究固定化酵母菌增殖能力的研究，請協(xié)助完成相關(guān)內(nèi)容．
海藻酸鈉與氯化鈣反應(yīng)產(chǎn)生海藻酸鈣，使凝膠珠有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；而檸檬酸鈉能與海藻酸鈣反應(yīng)，會(huì)使海藻酸鈣溶解．
實(shí)驗(yàn)材料（略）
主要實(shí)驗(yàn)步驟
步驟1：酵母菌的活化．
步驟2：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉溶液，滅菌冷卻→A→用注射器造凝膠顆粒→常溫下利用CaCl₂溶液固定凝膠顆粒．
步驟3：待固定化結(jié)束后，移去CaCl₂溶液，再用無菌水洗滌2〜3次．將固定化凝膠珠分成兩等份，取其中一份接種到固定化酵母增殖培養(yǎng)液中，在28℃下振蕩培養(yǎng)24h，得到固定化增殖酵母；另一份留用．
步驟4：將B放入一定體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液中，振蕩使凝膠珠完全溶解；再用無菌水適當(dāng)稀釋后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)計(jì)算出凝膠珠內(nèi)包埋的菌數(shù)，比較酵母菌在載體中的生長狀況．
請問答下列問題：
（1）完善實(shí)驗(yàn)步驟：A將酵母懸液與海藻酸鈉溶液按一定比例均勻混合；B等量增殖前后的固定化酵母凝膠珠．
（2）步驟1活化酵母菌的目的是使酵母菌恢復(fù)正常生活狀態(tài)．干酵母粉活化操作的主要注意事項(xiàng)是由于酵母細(xì)胞吸水后會(huì)膨脹，因此在活化時(shí)要使用較大的容器裝．
（3）步驟2中制得的凝膠珠直徑不宜過大，因?yàn)槟�膠珠相對表面積增大，不利于固定化酵母細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，實(shí)驗(yàn)中可以通過控制注射器針的大小，擠壓速度等實(shí)現(xiàn)對凝膠珠直徑的控制．步驟3中“用無菌水洗滌2〜3次”的主要目的是洗去CaCl₂，防止凝膠珠因固定時(shí)間過長而硬度過大，影響凝膠珠的通透性．
（4）在“步驟4”實(shí)驗(yàn)中，是否需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)？應(yīng)如何進(jìn)行？需要，重復(fù)取樣品液進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)．
（5）如圖所示曲線是某實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖可以得出的結(jié)論是固定化酵母增殖速率高于游離酵母．

Answer 1

分析 制作固定化酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟：1、酵母細(xì)胞的活化； 2、配制0.05mol/L的CaCl₂溶液； 3、配制海藻酸鈉溶液 （該實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵步驟）；4、海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合； 5、固定化酵母細(xì)胞．
固定化酶的優(yōu)點(diǎn)有：可多次使用、便于產(chǎn)物分離、提高產(chǎn)品質(zhì)量等．酵母細(xì)胞的活化→配制CaCl₂溶液→配制海藻酸鈉溶液→海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合→固定化酵母菌細(xì)胞．②物理吸附法、①化學(xué)結(jié)合法、③包埋法；制備固定化酵母細(xì)胞，常用的包埋材料是海藻酸鈉，使用方法如圖③．固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)，包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法．一般來說，酶更適合采用化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法固定，而細(xì)胞多采用包埋法固定化．這是因?yàn)榧?xì)胞個(gè)大，而酶分子很��；個(gè)大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個(gè)小的酶容易從包埋材料中漏出．

解答 解：（1）固定化酵母細(xì)胞的制各：配制2%每藻酸鈉溶液，滅菌冷卻→A將酵母懸液與海藻酸鈉溶液按一定比例均勻混合→用注射器造粒（直徑約為3mm珠狀顆粒）→常溫下固定36h．
固定化酵母增殖測定：將B等量增殖前后的固定化酵母凝膠珠放入一定體積的5%檸檬酸鈉溶液中，振蕩使凝膠珠完全溶解；再用無菌水適當(dāng)稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)凝膠球內(nèi)包埋的菌數(shù)，比較酵母菌在載體中生長狀況．
（2）步驟1活化酵母菌是指使酵母菌恢復(fù)正常生活狀態(tài)．干酵母粉活化操作的主要注意事項(xiàng)是由于酵母細(xì)胞吸水后會(huì)膨脹，因此在活化時(shí)要使用較大的容器裝．
（3）實(shí)驗(yàn)中可以通過控制注射器的針尖的大小對凝膠珠的大小進(jìn)行控制．步驟3中“用無菌水洗滌2〜3次”的主要目的是洗去CaCl₂，防止凝膠珠因固定時(shí)間過長而硬度過大，影響凝膠珠的通透性．
（4）在“步驟4”實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)取樣品液進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)．
（5）由圖可以得出的結(jié)論是固定化酵母增殖速率高于游離酵母．
故答案為：
（1）將酵母懸液與海藻酸鈉溶液按一定比例均勻混合    等量增殖前后的固定化酵母凝膠珠
（2）使酵母菌恢復(fù)正常生活狀態(tài)    由于酵母細(xì)胞吸水后會(huì)膨脹，因此在活化時(shí)要使用較大的容器裝
（3）控制注射器針的大小，擠壓速度等     洗去CaCl₂，防止凝膠珠因固定時(shí)間過長而硬度過大，影響凝膠珠的通透性
（4）需要，重復(fù)取樣品液進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)
（5）固定化酵母增殖速率高于游離酵母

點(diǎn)評 本題考查了制備和應(yīng)用固相化酶的相關(guān)知識(shí)，要求考生能夠識(shí)記制作固定化酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟，識(shí)記其中的關(guān)鍵步驟；能夠從比較表格中得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，難度適中．