Question

3．煙草花葉病毒（TMV）是一種在煙草及蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物中廣泛傳播的病毒，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大的危害．研究者利用植物基因工程的方法將煙草花葉病毒外殼蛋白基因（CP基因）導(dǎo)入煙草并在轉(zhuǎn)化的煙草植株中表達(dá)，使其獲得對(duì)煙草花葉病毒的抗性．如圖是轉(zhuǎn)化煙草植株的培育流程，請(qǐng)回答：

（1）含有CP基因的cDNA文庫(kù)是通過將TMV的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的．在對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，設(shè)計(jì)的引物自身不能含有互補(bǔ)序列．
（2）將CP基因?qū)�入土壤農(nóng)桿菌質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，其原因是T-DNA可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物染色體的DNA中．
（3）含重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌與煙草葉共培養(yǎng)前，對(duì)煙草葉的處理要求是無菌，并切成小片．
（4）共培養(yǎng)形成愈傷組織時(shí)的培養(yǎng)條件是必須避光有光或避光）．
（5）在配置誘導(dǎo)芽、根的培養(yǎng)基時(shí)，要注意在不同的培養(yǎng)階段需調(diào)整生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例．最終檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否成功，可用抗原-抗體雜交（或抗病接種實(shí)驗(yàn)）方法進(jìn)行檢測(cè)．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）以RNA為模板合成DNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄過程，故含有CP基因的cDNA文庫(kù)是通過將TMV的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的．在對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，設(shè)計(jì)的引物自身不能含有互補(bǔ)序列，否則兩引物會(huì)互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈．
（2）由于土壤農(nóng)桿菌T-DNA可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物染色體的DNA中，故將目的基因CP基因?qū)�入土壤農(nóng)桿菌質(zhì)粒的T-DNA區(qū)．
（3）含重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌與煙草葉共培養(yǎng)前，對(duì)煙草葉的處理要求是無菌，并切成小片．
（4）共培養(yǎng)形成愈傷組織時(shí)的培養(yǎng)條件是必須避光，形成葉綠體時(shí)則需要光照．
（5）生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比值較高時(shí)有利于生根，較低時(shí)有利于生芽，在配置誘導(dǎo)芽、根的培養(yǎng)基時(shí)，要注意在不同的培養(yǎng)階段需調(diào)整生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例．最終檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否成功，可用抗原-抗體雜交方法進(jìn)行檢測(cè)形成的蛋白質(zhì)．
故答案為：
（1）反轉(zhuǎn)錄   互補(bǔ)
（2）T-DNA區(qū)    T-DNA可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物染色體的DNA中
（3）無菌，并切成小片
（4）避光
（5）生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素     抗原-抗體雜交（或抗病接種實(shí)驗(yàn)）

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題，屬于考綱識(shí)記和理解層次的考查．