Question

【題目】下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題：

限制酶	EcoR Ⅰ	BamH Ⅰ	Sau3AI	SmaⅠ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

（1）一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割后，含有_______個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。

（2）根據(jù)限制酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)，應(yīng)選擇_________________酶對(duì)質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA進(jìn)行切割。用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能用BamH Ⅰ切割，原因是____________________________________________。

（3）通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入的引物有A、B兩種，引物A、B序列設(shè)計(jì)的依據(jù)是_______________________，若該目的基因擴(kuò)增4代，則需要消耗引物A____________個(gè)。

（4）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成_______種環(huán)狀DNA。重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了__________________________________。

Answer 1

【答案】2 EcoRⅠ、SmaⅠ BamHⅠ會(huì)破壞外源DNA中目的基因的結(jié)構(gòu)和質(zhì)粒中抗生素抗性基因的結(jié)構(gòu) 目的基因兩端的部分核苷酸序列 15 3 篩選出含有目的基因（或重組質(zhì)粒）的受體細(xì)胞

【解析】

分析圖1：質(zhì)粒上BamHⅠ、SmaⅠ、EcoR I和Sau3AⅠ四種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中BamHⅠ的切割位點(diǎn)位于抗生素抗性基因上。

分析圖2：外源DNA上含有BamHⅠ、SmaⅠ、EcoR I和Sau3AⅠ四種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中BamHⅠ的切割序列位于目的基因上。

（1）質(zhì)粒切割前是雙鏈環(huán)狀DNA分子，所有磷酸基團(tuán)參與形成磷酸二酯鍵，故不含游離的磷酸基團(tuán)。從圖1可以看出，質(zhì)粒上只含有一個(gè)SmaⅠ的切點(diǎn)，因此被該酶切割后，質(zhì)粒變?yōu)榫�性雙鏈DNA分子，因每條鏈上含有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，因此切割后含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。

（2）由圖1可知，質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因都含有BamHⅠ的切割位點(diǎn)，用BamHⅠ會(huì)破質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因，故根據(jù)限制酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)，應(yīng)選擇EcoRⅠ、SmaⅠ酶對(duì)質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA進(jìn)行切割。

（3）通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入的引物有A、B兩種，引物A、B序列是依據(jù)目的基因兩端的部分核苷酸序列來設(shè)計(jì)，若將1個(gè)含目標(biāo)片段的DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)n次后，共需要消耗引物的數(shù)量為2×2n-2=2（2n-1），則若將1個(gè)目的基因擴(kuò)增4代，則需要引物的數(shù)量為2（2n-1）=2×15=30個(gè)，其中引物A和引物B各15個(gè)。

（4）在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中對(duì)圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后，形成的含有2個(gè)酶切位點(diǎn)的片段有2種，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成3種環(huán)狀DNA，重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了篩選出含有目的基因（或重組質(zhì)粒）的受體細(xì)胞。