Question

5．為研究水稻D基因的功能，研究者將T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d．現(xiàn)以野生植株和突變植株作為親本進行雜交實驗，統(tǒng)計母本植株的結實率，結果如下表所示．

雜交編號	親本組合	結實數(shù)/授粉的小花數(shù)	結實率
①	♀DD×♂dd	16/158	10%
②	♀dd×♂DD	77/154	50%
③	♀DD×♂DD	71/141	50%

（1）表中數(shù)據(jù)表明，D基因失活使雄配子育性降低．為確定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可將D基因作為目的基因，與載體連接后，導入到突變（填“野生”或“突變”）植株的幼芽經(jīng)過脫分化（或“去分化”）形成的愈傷組織中，最后觀察轉基因水稻配子育性是否得到恢復．
（2）用顯微鏡觀察并比較野生植株和突變植株的配子形成，發(fā)現(xiàn)D基因失活不影響二者的減數(shù)分裂．
（3）進一步研究表明，配子育性降低是因為D基因失活直接導致配子本身受精能力下降．若讓雜交①的F₁給雜交②的F₁授粉，預期結實率為30%，所獲得的F₂植株的基因型及比例為DD：Dd：dd=5：6：1．
（4）為驗證F₂植株基因型及比例，研究者根據(jù)D基因、T-DNA的序列，設計了3種引物，如圖所示：
隨機選取F₂植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進行PCR，檢測是否擴增（完整的T-DNA過大，不能完成PCR）．若兩種引物組合均可完成擴增，則相應植株的基因型為Dd；同理可判斷其他基因型，進而統(tǒng)計各基因型比例．
（5）研究表明D基因表達產(chǎn)物（D蛋白）含有WD40（氨基酸序列），而通常含有WD40的蛋白都定位在細胞核內(nèi)．為探究D蛋白是否為核蛋白，研究者將D基因與黃色熒光蛋白基因融合；同時將已知的核蛋白基因與藍色熒光蛋白基因融合．再將兩種融合基因導入植物原生質體表達系統(tǒng)，如果兩種熒光的定位（模式）相同（或“兩種熒光同時出現(xiàn)在細胞核中”），則表明D蛋白是核蛋白．

Answer 1

分析 分析表格：②③組都是DD做父本，結實率都為50%，①組是dd做父本，結實率為10%．所以可以猜測D基因失活后會使雄配子的育性降低．且DD做父本，結實率都為50%，可以得出D的雄配子中可育的占$\frac{1}{2}$；dd做父本，結實率為10%，可以得出d的雄配子中可育的占$\frac{1}{10}$．

解答 解：（1）②③兩組中雄性個體的基因型均為DD，不論雌性個體的基因型是什么，后代結實率均為50%，說明D基因失活與雌配子的育性無關；又已知①中雄性個體的基因型為dd（D基因失活），后代結實率只有10%，說明D基因失活使雄配子育性降低．愈傷組織是外植體脫分化形成的．為確定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可將D基因作為目的基因，與載體連接后，導入到突變植株的愈傷組織中，最后觀察轉基因水稻配子育性是否得到恢復．
（2）配子是減數(shù)分裂形成的，而減數(shù)分裂過程可用顯微鏡進行觀察．
（3）在第（1）小問中：DD做父本，結實率都為50%，可以得出D的雄配子中可育的占$\frac{1}{2}$；dd做父本，結實率為10%，可以得出d的雄配子中可育的占$\frac{1}{10}$．若讓雜交①的F₁（Dd）給雜交②的F₁（Dd）授粉，則結實率為（10%+50%）÷2=30%．若讓雜交①的F₁（Dd）給雜交②的F₁（Dd）授粉，兩者基因型都為Dd，產(chǎn)生的配子都為D：d=1：1．但是雄配子的可育性D是d的5倍，所以可育的雄配子D：d=5：1，可育的雌配子D：d=1：1．那么就會有如下的雜交結果：

（4）
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ引物的結合位點如上圖所示，根據(jù)題中信息“完整的T-DNA過大，不能完成PCR”，且d基因的產(chǎn)生是T-DNA插入了D基因內(nèi)部，所以如果以D基因為模板，Ⅱ、Ⅲ引物組合可以擴增出一種片段，以突變后的D基因（d基因）為模板，Ⅰ、Ⅲ引物組合可以擴增出另外一種片段．如果某植株的基因型是Dd，則從其體內(nèi)提取出來的作為擴增的模板就有兩種，兩種引物組合都能夠進行擴增．
（5）從題中信息可以看到有一個對照實驗：對照組：已知的核蛋白基因+藍色熒光蛋白基因→植物原生質體表達系統(tǒng)；實驗組：D蛋白基因+黃色熒光蛋白基因→植物原生質體表達系統(tǒng)．所以，如果兩種顏色的熒光都出現(xiàn)在細胞核內(nèi)，就表明D蛋白是核蛋白．
故答案為：
（1）雄    D基因    突變     脫分化（或“去分化”）
（2）顯微鏡    減數(shù)
（3）30%    DD：Dd：dd=5：6：1
（4）兩種引物組合均可完成擴增
（5）兩種熒光的定位（模式）相同（或“兩種熒光同時出現(xiàn)在細胞核中”）

點評 本題考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟需要注意的細節(jié)，能結合表中和圖中信息準確答題，難度較大，需要考生有牢固的基礎知識和較高的圖文分析能力．