Question

【題目】科研工作者利用胚胎干細(xì)胞和基因敲除技術(shù)改造老鼠體內(nèi)的特定靶基因，使實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)的靶基因失去作用，從而發(fā)現(xiàn)這些基因的實(shí)際功能，這種技術(shù)的應(yīng)用，使我們能夠更深入地了解胚胎發(fā)育、老化以及疾病的過程�；�因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段（部分序列與靶基因相同，從而使該片段特異性插入靶基因）使靶基因突變而達(dá)到基因敲除的目的。原理如圖：

科研工作者獲取穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除小鼠一般經(jīng)歷下列過程：

（1）獲取干細(xì)胞懸浮液

科學(xué)家將動(dòng)物胚胎組織用_____________處理使其細(xì)胞離散 ，再通過CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。CO2的作用是_________________；胚胎干細(xì)胞分化為不同組織器官的原因是 __________________________________。

（2）構(gòu)建重組DNA分子

構(gòu)建含有“同源性片段”的重組DNA分子時(shí)要用到的工具酶有________________；該實(shí)驗(yàn)病毒的作用是_____________。

（3）獲取含重組基因的干細(xì)胞

基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低（動(dòng)物的重組概率為10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的標(biāo)記基因作用非常重要，可采用__________________技術(shù)檢測(cè)或利用選擇培養(yǎng)基篩選。靶基因被插入同源性片段后發(fā)生基因突變，該特異性插入突變克服了自然誘發(fā)突變或人工物理、化學(xué)誘發(fā)突變的______________特點(diǎn)，便于專一性研究靶基因的功能。

（4）將重組的胚胎干細(xì)胞通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚泡（囊胚中），然后將胚泡植入受體小鼠子宮中，獲取子代嵌合體小鼠。其中一些子代小鼠的配子不含無活性基因，原因可能是____________________（答出2點(diǎn)）。X代中含有無活性基因的雌鼠和雄鼠均為_________________。

（5）獲取基因敲除純合子小鼠

假設(shè)已獲取1只雌性基因敲除雜合子小鼠。用遺傳圖解表示利用該鼠通過雜交實(shí)驗(yàn)獲得純合基因敲除小鼠的過程。（靶基因用A表示，插入同源片段的靶基因用A+表示 ）

________________________

Answer 1

【答案】 胰蛋白酶 調(diào)節(jié)pH 基因的選擇性表達(dá) 限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶 載體 DNA分子雜交 隨機(jī)性和不定向性 子代小鼠可能為雜合子； 重組胚胎干細(xì)胞未分化為精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞 雜合子

【解析】試題分析：基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的，由此可見，基因敲除可定向改變生物體的某一基因，基因敲除既可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正常基因，也可以用正常基因敲除相應(yīng)的突變基因，因此利用基因敲除技術(shù)可以修復(fù)細(xì)胞中的病變基因來治療基因遺傳病，但不能治療染色體異常遺傳病。

（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)用胰蛋白酶處理胚胎組織使其分散成單個(gè)細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的氣體環(huán)境是95%的空氣+5%二氧化碳的混合氣體，CO2起到調(diào)節(jié) PH值作用。胚胎干細(xì)胞具有分裂和分化能力，能分化成不同組織器官，原因是基因的選擇性表達(dá)。

（2）構(gòu)建同源性片段的重組DNA分子時(shí)，先要使用限制性內(nèi)切酶對(duì)供體基因和運(yùn)載體進(jìn)行切割，然后再使用DNA連接酶連接，形成重組DNA分子，在使用病毒將重組DNA分子運(yùn)入到受體細(xì)胞，因此該病毒的作用是載體。

（3）標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因，檢測(cè) 受體細(xì)胞中的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。靶基因被插入同源性片段后發(fā)生基因突變，該特異性插入突變克服了自然誘發(fā)突變或人工物理、化學(xué)誘發(fā)突變的隨機(jī)性和不定向性特點(diǎn)，便于專一性研究靶基因的功能。

（4）重組的胚胎干細(xì)胞通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚泡，獲取子代嵌合體小鼠，一些子代小鼠的配子不含無活性基因，原因可能是子代小鼠可能為雜合子或重組胚胎干細(xì)胞未分化為精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞，由于正常小鼠中不含有同源片段的靶基因，因此X代中含有無活性基因的雌鼠和雄鼠均為雜合子。

（5）雌性基因敲除雜合子小鼠基因型為AA+，可利用該鼠與基因型為AA的雄鼠雜交，獲得子一代基因型為AA+雌雄小鼠再交配，可獲得基因敲除純合子小鼠（即A+A+）。遺傳圖如下：