Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）黃素單加氧酶（FMO）是轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)（一種染料）的一種重要的酶。為提高表達(dá)FMO的重組大腸桿菌合成靛藍(lán)的效率，對重組菌進(jìn)行了固定化研究。回答下列問題：

（1）重組大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：用_______________________挑取大腸桿菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，放在______________________ （ 填設(shè)備）上培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物1mL轉(zhuǎn)移至100mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。該過程所用培養(yǎng)基對于酸堿度的要求是_________________。

（2）重組大腸桿菌的固定化：分別使用卡拉膠、明膠、聚乙烯醇（網(wǎng)格較緊密，擴(kuò)散性能最低）、海藻酸鈉對重組大腸桿菌進(jìn)行________ （填固定化方式）并分析各自對_________的轉(zhuǎn)化效率。

（3）靛藍(lán)取轉(zhuǎn)化液5mL，離心后，沉淀部分用于靛藍(lán)分析。沉淀用蒸餾水洗兩遍，再用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再離心，取上清液于610nm處測定OD值，和________________對照即得到靛藍(lán)濃度。若所測得的OD值過大應(yīng)采用的最佳措施是________________________。

（4）影響重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)效率的因素有很多，如：工程菌FMO誘導(dǎo)表達(dá)的條件、固定化顆粒的理化性質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度、輔助因子的再生、________________、________________（答出2 點(diǎn)即可）等。

（二）對疑似PRRS（豬繁殖與呼吸綜合征）的病料（從得病的動物身上采集的組織或器官）進(jìn)行病毒分離鑒定，獲得一株高致病性PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒） ，通過對高致病性PRRSV的N蛋白進(jìn)行研究來探討該蛋白的抗原特性，并制備抗N蛋白的單克隆抗體。回答下列問題：

（1）PRRSV N 蛋白基因的克�。禾崛�PRRSV中的總RNA，以其中相應(yīng)的RNA作為模板，利用________________酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行________________擴(kuò)增，而獲得N蛋白基因。

（2）表達(dá)N蛋白細(xì)胞的制備：用重組質(zhì)粒________________合適的大腸桿菌細(xì)胞，為提高該過程的效率，需考慮重組質(zhì)粒的___________________________等。將篩選過的受體細(xì)胞 37℃過夜培養(yǎng)。

（3）單克隆抗體的制備與檢測：取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合待融合細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔底面積的1/10時(shí)進(jìn)行________________________（填物質(zhì)）篩選。檢出的陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行多次克隆化，建立單克隆抗體________________。最終獲得的單克隆抗體是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的標(biāo)志是_________________________，與無關(guān)蛋白不發(fā)生反應(yīng)。

（4）豬干細(xì)胞的應(yīng)用：胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行________________________________，獲得適合猴子移植的豬器官，減弱或消除排斥反應(yīng)。

Answer 1

【答案】接種環(huán) 搖床 中性偏堿 包埋 吲哚 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用蒸餾水稀釋樣品液 固定化條件 轉(zhuǎn)化過程中底物的濃度 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 轉(zhuǎn)化 質(zhì)量和濃度 抗體 細(xì)胞株N蛋白 抗N 蛋白的單克隆抗體可與N 蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合 基因敲除

【解析】

（1）梳理大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和分離、固定化細(xì)胞的方法、亞硝酸鹽的定量測定流程等相關(guān)知識，即可對（一）題進(jìn)行解答。
（2）基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：一是目的基因的獲取，常用的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增、用化學(xué)方法直接人工合成；二是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，此步驟需要將目的基因與運(yùn)載體重組；三是將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化；四是目的基因的檢測與鑒定。
（3）單克隆抗體的制備過程：將從免疫小鼠的脾臟中取出的B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合→形成雜交細(xì)胞→檢驗(yàn)雜交細(xì)胞是否產(chǎn)生特定抗體→克隆產(chǎn)生特定抗體的雜交細(xì)胞→在體外進(jìn)行培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖→單克隆抗體。（四）動物基因工程的應(yīng)用之一是用轉(zhuǎn)基因動物做器官移植的供體：將供體器官基因組導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達(dá)，或設(shè)法除去抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的克隆器官。

（一）(1)應(yīng)使用LB液體培養(yǎng)基對重組大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在此過程中要用接種環(huán)挑取大腸桿菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中。接種后，應(yīng)放在搖床上振蕩培養(yǎng)。細(xì)菌要求在中性偏堿(6.5～7.5)的環(huán)境中生長，所以該過程所用培養(yǎng)基對于酸堿度的要求是中性偏堿。

(2)因大腸桿菌細(xì)胞個(gè)大，難以被吸附或結(jié)合，所以多采用包埋法對重組大腸桿菌進(jìn)行固定化。依題意可知：黃素單加氧酶（FMO）是轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)（一種染料）的一種重要的酶，該實(shí)驗(yàn)對重組菌進(jìn)行固定化研究的目的是為提高表達(dá)FMO的重組大腸桿菌合成靛藍(lán)的效率，所以需要分析被不同材料固定化的大腸桿菌各自對吲哚的轉(zhuǎn)化效率。

(3) 分析靛藍(lán)時(shí)，取上清液于610nm處測定的OD值，需要與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照才能得到靛藍(lán)濃度。若所測得的OD值過大，則應(yīng)用蒸餾水稀釋樣品液。

(4) 固定化條件、轉(zhuǎn)化過程中底物的濃度等都會影響FMO的活性，進(jìn)而影響重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)效率。

（二）(1) 以RNA為模板合成cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶參與催化。以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)可以對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而獲得N蛋白基因。

(2) 制備表達(dá)N蛋白的細(xì)胞，需將N蛋白基因與質(zhì)粒重組，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中。N蛋白基因進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，并在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。為提高轉(zhuǎn)化的效率，需考慮重組質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度等。

(3) 制備單克隆抗體時(shí)，首先取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，待融合細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔底面積的1/10時(shí)進(jìn)行抗體篩選。檢出的陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行多次克隆化，建立單克隆抗體細(xì)胞株N蛋白。若最終獲得的單克隆抗體可與N 蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，與無關(guān)蛋白不發(fā)生反應(yīng)，則達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

(4) 將豬的胚胎干細(xì)胞中的抗原決定基因敲除，再結(jié)合克隆技術(shù)，獲得適合猴子移植的豬器官，以減弱或消除排斥反應(yīng)。