Question

【題目】單克隆抗體在診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用。已知一般細胞的DNA合成途徑有起始合成途徑和中間合成途徑兩種，氨基蝶呤（A）可以阻礙起始合成途經(jīng)，次黃嘌呤（H）及胸腺嘧啶核苷（T）則是中間合成途徑所必需的物質(zhì)。骨髓瘤細胞只有起始合成途徑。在HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）。下面是制備單克隆抗體的基本步驟：

步驟1：對小鼠多次注射特定抗原，制備淋巴細胞。

步驟2：細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)。最后一次免疫后第3天制備脾細胞懸液；篩選出？途徑缺失的骨髓瘤細胞，于對數(shù)生長期（又稱指數(shù)生長期，即細胞以指數(shù)形式增加）制備骨髓瘤細胞懸液；取適量的脾細胞與骨髓瘤細胞進行混合，對它們進行誘導(dǎo)融合處理；用HAT培養(yǎng)基對處理后的細胞進行培養(yǎng)。

步驟3：二次篩選。

步驟4：大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞，批量生產(chǎn)單克隆抗體。

回答下列問題：

（1）步驟1中對小鼠多次注射特定抗原的目的是________________________；實驗所需淋巴細胞可由________________細胞增殖分化而來。

（2）于對數(shù)生長期制備骨髓瘤細胞懸液的原因是________________________________；為使HAT培養(yǎng)基上只有雜交瘤細胞可以存活，步驟2中應(yīng)填________。

（3）步驟3中二次篩選可通過________________________法進行目的抗體的檢測，篩選出________________細胞。

（4）在體外對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)時，為維持無菌無毒的環(huán)境，應(yīng)進行的操作是_______________________________________________________________________。實驗發(fā)現(xiàn)，在雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)層細胞比不加的生長要好，可能的原因是________________________________________。

Answer 1

【答案】增加相應(yīng)B淋巴細胞的數(shù)量 B細胞和記憶 對數(shù)期的細胞增殖速率較快 中間合成 抗原—抗體雜交 目的抗體檢驗呈陽性的雜交瘤（能夠分泌目的抗體的雜交瘤） 對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素、定期更換培養(yǎng)液 飼養(yǎng)層細胞可以產(chǎn)生一些促生長因子

【解析】

1.動物細胞培養(yǎng)條件

（1）無菌、無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防止細胞代謝產(chǎn)物累積對細胞自身產(chǎn)生危害；

（2）營養(yǎng)物質(zhì)：無機物(無機鹽、微量元素等)，有機物(糖、氨基酸、促生長因子等)血清和血漿 (提供細胞生長必須的營養(yǎng)成份)；

（3）溫度和pH(36.5±0.5℃，7.2~7.4)；

（4）氣體環(huán)境(95%的空氣+5%CO2的混合氣體)其中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定。

2.單克隆抗體制備的原理：

B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠增殖、分化形成分泌特定抗體的效應(yīng)B細胞。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種雜交瘤細胞既能無限增殖，又能分泌特異性抗體，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。

（1）制備單克隆抗體的前提是首先獲得效應(yīng)B細胞，為了獲得更多的相應(yīng)的B淋巴細胞，實驗中需要對小鼠多次注射特定抗原；實驗所需的效應(yīng)B細胞可由B細胞和記憶細胞在抗原的刺激下增殖分化而來。

（2）因為處于對數(shù)期的細胞增殖速率較快，適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境的能力強，因此選擇處于對數(shù)生長期制備骨髓瘤細胞懸液用于實驗；一般細胞的DNA合成途徑有起始合成途徑和中間合成途徑兩種，而骨髓瘤細胞只有起始途徑，為了將雜交瘤細胞選出來，在步驟2中應(yīng)選擇中間合成途徑缺失的骨髓瘤細胞，在HAT培養(yǎng)基上雜交瘤細胞能利用效應(yīng)B細胞的中間途徑進行增殖。因為在HAT培養(yǎng)基中阻斷了DNA合成的起始途徑，骨髓瘤細胞以及骨髓瘤細胞自融的細胞因為起始途徑被阻斷而無法增殖。效應(yīng)B細胞以及效應(yīng)B細胞互融的細胞沒有增殖能力。

（3）步驟3中二次篩的目的是要篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，通常可根據(jù)抗原抗體能夠發(fā)生特異性結(jié)合的方法來檢測，即用抗原—抗體雜交法進行目的抗體的檢測，從而將能夠分泌目的抗體的雜交瘤細胞篩選出來。

（4）動物細胞培養(yǎng)需要在無菌、無毒的環(huán)境中進行，因此，在體外對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)時，需要對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，并同時在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素以維持無菌、無毒環(huán)境，具體培養(yǎng)過程中還需要定期更換培養(yǎng)基。實驗中發(fā)現(xiàn)，在雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)層細胞比不加的生長要好，根據(jù)動物細胞培養(yǎng)的條件可知，加入飼養(yǎng)層細胞生長好的可能原因是飼養(yǎng)層細胞可以產(chǎn)生一些促生長因子。