Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動(dòng)物領(lǐng)域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

(1)步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是_________�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了________和________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是：Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶有________個(gè)切割位點(diǎn)，酶切后，目的基因形成的兩個(gè)黏性末端序列_______(相同/不相同)

(2)步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需元件還有________，步驟③中需先用________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

(3)步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過(guò)________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測(cè)出干擾素基因，其可能原因是________________。

Answer 1

【答案】 雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同 復(fù)制原點(diǎn) Ca2+ 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄 或雞干擾素的mRNA 已經(jīng)被水解

【解析】試題分析：本題考查基因工程，考查對(duì)目的基因獲取、基因表達(dá)載體構(gòu)建等基因工程步驟的理解，解答此題，可根據(jù)圖中切割目的基因和質(zhì)粒時(shí)所用的限制酶判斷目的基因兩端應(yīng)添加的堿基序列，根據(jù)基因表達(dá)的環(huán)節(jié)分析愈傷組織細(xì)胞中不能檢測(cè)出干擾素基因的原因。

(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增雞干擾素基因時(shí)，引物應(yīng)可以和雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列可設(shè)計(jì)引物的堿基序列。據(jù)圖可知，該轉(zhuǎn)基因過(guò)程用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，以避免質(zhì)粒或目的基因的自身連接，應(yīng)在兩種引物的一端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列GAATTC和GGATCC，以便于后續(xù)的剪切和連接。Ti質(zhì)粒中每種限制酶有1個(gè)切割位點(diǎn)，則酶切產(chǎn)物兩端粘性末端不同，不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化。

(2)基因表達(dá)載體中除含有啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和目的基因外，還應(yīng)含有復(fù)制原點(diǎn)，以便在宿主細(xì)胞中復(fù)制。將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，可用Ca2+處理農(nóng)桿菌，以增大細(xì)胞壁通透性，提高轉(zhuǎn)化效率。

(3提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA。雞干擾素基因即便導(dǎo)入了農(nóng)桿菌，也不一定能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞，導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因不一定能夠正常轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出的雞干擾素的mRNA 若被水解，則不能通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得雞干擾素基因，以上原因均可能導(dǎo)致愈傷組織細(xì)胞中不能檢測(cè)出雞干擾素基因。