Question

16．Rag₂基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細(xì)胞．科研人員利用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）對Rag₂基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療．其技術(shù)流程如圖：

（1）步驟①中所選的卵母細(xì)胞應(yīng)處于減數(shù)第二次分裂中期．
（2）步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到囊胚期時，可從其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出ES細(xì)胞，ES細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大，核仁明顯的特點(diǎn)．
（3）步驟③中，需要構(gòu)建含有Rag₂基因的表達(dá)載體．可以根據(jù)Rag₂基因的核苷酸序列設(shè)計合成引物，利用PCR技術(shù)技術(shù)擴(kuò)增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在目的基因所在DNA片段兩側(cè)進(jìn)行酶切獲得Rag₂基因片段．為將該片段直接連接到表達(dá)載體，所選擇的表達(dá)載體上應(yīng)具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位點(diǎn)．
（4）為檢測Rag₂基因的表達(dá)情況，可提取治療后小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)，用抗Rag₂蛋白的抗體進(jìn)行雜交．

Answer 1

分析 1、動物核移植的概念：將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核移入一個去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體．
2、胚胎干細(xì)胞簡稱ES或EK細(xì)胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）．
3、在基因工程中，目的基因和質(zhì)粒需要用同種限制酶進(jìn)行切割，形成相同的黏性末端，再用DNA連接酶連接成重組質(zhì)粒．
4、目的基因分子水平上的檢測：
①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)
②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)
③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)

解答 解：（1）步驟①核移植中所選的卵母細(xì)胞應(yīng)處于減數(shù)第二次分裂中期．
（2）胚胎干細(xì)胞簡稱ES或EK細(xì)胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）．故步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到囊胚期時，可從其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出ES細(xì)胞，ES細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大，核仁明顯的特點(diǎn)．
（3）步驟③中，需要構(gòu)建含有Rag₂基因的表達(dá)載體，設(shè)計引物要遵循堿基互補(bǔ)配對原則，所以根據(jù)Rag₂基因的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計．Rag₂基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割獲得的，所以表達(dá)載體應(yīng)具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位點(diǎn)．
（4）基因表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，所以提取小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原-抗體雜交．
故答案為：
（1）減數(shù)第二次分裂中
（2）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)   細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大，核仁明顯
（3）表達(dá)載體  引物  PCR   HindⅢ和PstⅠ
（4）雜交

點(diǎn)評 題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細(xì)胞工程以及胚胎工程等方面的知識，難度適中．考生要能夠識記細(xì)胞核移植的過程；識記囊胚包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層兩部分；明確基因工程中質(zhì)粒和目的基因需要利用同種限制酶進(jìn)行切割；掌握目的基因檢測和鑒定的一般方法等．