Question

【題目】紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2和CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白。請回答下列有關(guān)問題：

（1）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，加入檸檬酸鈉的目的是________。洗滌紅細胞時要用________反復(fù)洗滌、離心。要讓紅細胞破裂，釋放血紅蛋白時要加入________。

（2）得到的血紅蛋白溶液裝入透析袋中透析，即血紅蛋白的粗分離，目的是除去________。

（3）然后通過________（填方法）將樣品進一步純化，最后進行純度鑒定，使用最多的是________（填方法）。

（4）在凝膠色譜操作過程中,不能發(fā)生_________，露出凝膠顆粒的情況,一旦發(fā)生這種情況,需重新裝填凝膠色譜柱。如果紅色區(qū)帶______,說明色譜柱制作成功。

Answer 1

【答案】防止血液凝固 生理鹽水 蒸餾水和甲苯 去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 凝膠色譜法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 洗脫液流干 均勻、一致地移動

【解析】

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。實驗步驟 ：（1）樣品處理：①紅細胞的洗滌，洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放，在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白，加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。③分離血紅蛋白溶液，將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層，第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。④透析，取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h，透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。（2）凝膠色譜操作，凝膠色譜法所用的凝膠是一種微小的多孔球體，在小球內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離，通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，實現(xiàn)樣品的純化。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整的隨著洗脫液緩慢流出。（3）純度鑒定，判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求，可利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。

（1）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固。洗滌紅細胞時要用生理鹽水反復(fù)洗滌、離心，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。為了讓紅細胞破裂，要加入蒸餾水和甲苯。

（2）得到的血紅蛋白溶液裝入透析袋中透析，透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

（3）然后通過凝膠將色譜法對樣品進一步純化，最后進行純度鑒定，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

（4）在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙：一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果；二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象；一旦發(fā)生上述情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。在蛋白質(zhì)分離過程中，需仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。