Question

【題目】蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對(duì)人體沒有影響。我國(guó)科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關(guān)研究。

（1）研究者用相同的________酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)________處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。

（2）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），并按圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。

①這是利用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)的________。

②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請(qǐng)?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1
PCR2
PCR3
PCR4

________

（3）研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和________分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用________方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長(zhǎng)滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較________的大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點(diǎn)是________________。

Answer 1

【答案】限制酶和DNA連接 CaCl2 基因突變

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒） 抗原-抗體雜交 抑菌圈 對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全；不會(huì)造成基因污染；有效成分純度較高

【解析】

本題主要考查基因工程、PCR技術(shù)等相關(guān)知識(shí)。PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：DNA雙鏈復(fù)制；過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。

（1）在基因工程中，利用相同的限制酶和DNA連接酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒；大腸桿菌作為受體細(xì)胞，需要用氯化鈣處理，以便重組質(zhì)粒的導(dǎo)入。
（2）①根據(jù)題意和圖示分析，經(jīng)過4次PCR技術(shù)后獲得了新的基因，這是一種定點(diǎn)的基因突變技術(shù)。
②研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），DNA子鏈從5'端向3'端延伸，因此4次PCR應(yīng)該分別選擇如圖所示的引物：如下表所示。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

（3）將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒）分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用抗原-抗體雜交方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長(zhǎng)滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較抑菌圈的大小，可以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。
（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，是因?yàn)榈鞍?/span>A基因的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全；不會(huì)造成基因污染；有效成分純度較高。