Question

【題目】Sanger法DNA測(cè)序技術(shù)的核心原理：由于雙脫氧核苷酸（ddNTP）的2＇和3＇都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應(yīng)。在四個(gè)含有4種脫氧核苷酸（dNTP）的DNA體外合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分別為：ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP），在PCR過程中復(fù)制隨機(jī)終止，產(chǎn)生四組不同長(zhǎng)度的一系列終止處帶有標(biāo)記的DNA片段。然后在變性凝膠（加入尿素等堿性物質(zhì)）上進(jìn)行電泳和放射自顯影后，可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列，具體過程見下圖。

注：ddA是ddATP的縮寫形式。

（1）上圖Ⅰ過程橫線①中應(yīng)該加入的物質(zhì)是_____________，dNTP中dATP與ATP在組成上的區(qū)別是_____________，為什么該過程中需要添加引物？_____________

（2）材料中提到“在變性凝膠上進(jìn)行電泳…”，請(qǐng)解釋“變性”_____________，為什么要變性處理？_____________

（3）如果電泳結(jié)果如圖所示，請(qǐng)寫出待測(cè)DNA分子的序列_____________。

（4）某同學(xué)要通過PCR技術(shù)獲得被32P標(biāo)記且以堿基“C”為末端、不同長(zhǎng)度的子鏈DNA片段，在反應(yīng)管中已經(jīng)有模板、引物、酶和相應(yīng)緩沖液等等，還需加入哪些原料_____________。

Answer 1

【答案】耐高溫的DNA聚合酶 dATP中五碳糖為脫氧核糖、ATP中五碳糖為核糖 DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有的核酸片段上 破壞DNA分子中的氫鍵，獲得單鏈 避免模板鏈對(duì)結(jié)果的影響 dATP、dGTP、dTTP、dCTP、ddCTP

【解析】

PCR技術(shù)：

1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

2、原理：DNA復(fù)制。

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物。

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）

5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

（1）圖1過程Ⅰ橫線①處加入的物質(zhì)是催化脫氧核苷酸形成長(zhǎng)鏈的Taq酶，所以是耐高溫的DNA聚合酶；dATP中五碳糖為脫氧核糖、ATP中五碳糖為核糖；該過程需要添加引物的原因是DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有核酸片段上。

（2）題干中“在變性凝膠上進(jìn)行電泳……”中“變性”是指破壞DNA分子中氫鍵，獲得單鏈，其目的是避免模板鏈對(duì)結(jié)果的影響（或使模板鏈與子鏈分離，使電泳結(jié)果直接反映子鏈的長(zhǎng)度，便于讀序）。

（3）根據(jù)電泳結(jié)果的先后順序，寫出DNA分子序列：。

（4）要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增的原料有dATP、dGTP、dTTP、dCTP，獲得被32P標(biāo)記且以堿基“C”為末端、不同長(zhǎng)度的子鏈DNA片段還需要原料ddCTP，所以需要加入dATP、dGTP、dTTP、dCTP、ddCTP。