Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是近年來頗受關注的一項新技術。該基因表達系統(tǒng)主要包含引導RNA和Cas9蛋白兩個部分，引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結合到相應位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題：

（1）研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助____________技術才能在水稻細胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與_____________酶的功能相似。

（2）首先依據___________的部分序列設計DNA片段A（負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體（如圖所示）。位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示_____________酶切位點。

（3）質粒B大小為2.5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對），連接形成的表達載體大小為___________kb。

（4）常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，依據農桿菌的侵染特點，目的基因將插入到Ti質粒的_______上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到____________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。

（5）CRISRP/Cas9基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導RNA的角度分析脫靶的原因_________________________________________________。

Answer 1

【答案】轉基因（DNA重組或基因工程） 限制酶 Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ 2.94kb T-DNA 水稻細胞染色體的DNA上 其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合而脫靶

【解析】

根據題意分析可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是利用該基因表達系統(tǒng)中的引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結合到相應位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合而出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。Ti質粒是農桿菌中的一種質粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti質粒的T-DNA中是利用了T-DNA可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA分子上。

（1）若將原核生物的基因導入真核生物中并表達，需要利用基因工程技術。根據題干信息“Cas9蛋白結合到相應位置并剪切DNA”，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。

（2）由于是對水稻產量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據Q基因的部分序列設計DNA片段A（負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體（如圖所示）。根據片段A兩端的限制酶種類以及片段A連接在位點Ⅰ、位點Ⅱ之間，可知位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點。

（3）質粒B大小為2.5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對），連接形成的表達載體大小為2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，由于農桿菌的Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到水稻細胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。

（5）由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合，從而導致CRISRP/Cas9基因編輯技術會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。