如圖表示含有目的基因D的DNA片段長度(bp即堿基對)和部分堿基序列,圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列.現(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG.請回答下列問題:
(1)用圖1中的外源DNA(含有目的基因D)和圖2中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和
.前者(酶)的專一性很強,其作用特點是
.
(2)應(yīng)該使用限制酶BamHⅠ同時處理質(zhì)粒、外源DNA,而不選擇其他3種,原因在于
.(多選) A.若使用SmaⅠ或者MspⅠ會破壞目的基因.
B.若使用SmaⅠ切割質(zhì)粒,能成功切開質(zhì)粒得到粘性末端的可能很低.
C.若使用MboⅠ切割質(zhì)粒,質(zhì)粒上會有2處被切開,會將質(zhì)粒切成兩段不利于篩選.
D.使用限制酶BamHⅠ能保證目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端,以便目的基因和運載體定向連接,不至于反向連接.
E.使用BamHⅠ切割質(zhì)粒,質(zhì)粒上會有1處被切開,破壞抗生素A抗性基因,保留抗生素B抗性基因,以便于將來篩選含目的基因的受體細胞.
F.只有使用BamHⅠ切割,才能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端.
(3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換,那么基因D就突變?yōu)榛騞.從雜合子分離出圖1及其對應(yīng)的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,產(chǎn)物中共有
種不同DNA片段.若同時用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒,則可得到
個DNA片段.
(4)為了篩選出成功導(dǎo)入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌,一般可進行如下步驟篩選:
第一步:將大腸桿菌在含
的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖3的菌落.
第二步:再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上,使絨布面沾上菌落,然后將絨布按到含
的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖4的結(jié)果(空圈表示與圖3對照無菌落的位置).
第三步:選出圖3培養(yǎng)皿中的某些菌落進行培養(yǎng),即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌.請在圖3中圈出含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落
以上篩選方式至少需要兩步,其實還有其他更簡單的操作方法.請閱讀下列材料,回答問題.
大腸桿菌pUC118質(zhì)粒的某限制酶唯一酶切序列,位于該質(zhì)粒的lacZ基因中.lacZ基因中如果沒有插入外源基因,便可表達出β-半乳糖苷酶.當培養(yǎng)基中含有A物質(zhì)時,A物質(zhì)便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色,大腸桿菌將形成藍色菌落;如果lacZ基因中插入了外源基因,帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達β-半乳糖苷酶,培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會被水解成藍色,大腸桿菌將形成白色菌落.pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因.如圖5是利用lacZ基因篩選重組質(zhì)粒示意圖.
(5)用圖5中的培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的受體大腸桿菌,制備時除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外還應(yīng)加入物質(zhì)應(yīng)包括
(多選) A.伊紅美藍試劑 B.瓊脂 C.A物質(zhì) D.氨芐青霉素 E.四環(huán)素 F.噬菌體
(6)將上述處理后的大腸桿菌置于圖5中培養(yǎng)基上培養(yǎng),以檢測受體大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒,結(jié)果可能出現(xiàn)藍色或者白色菌落,其中
色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌.