Question

科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素--油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝．研究人員發(fā)現(xiàn)，用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因（如圖P450）的表達(dá)和酶活性都得到提高，在這些基因的“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒無(wú)毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外，某課題組進(jìn)一步進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)操作：

（1）上述油菜素內(nèi)酯基因的擴(kuò)增利用了PCR技術(shù)．其過(guò)程是：目的基因DNA

 

后解旋為單鏈；加入

 

與單鏈相互互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，如此循環(huán)．
（2）基因工程的基本操作程序包括4個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定．請(qǐng)根據(jù)上圖，寫(xiě)出以上4個(gè)步驟的具體操作內(nèi)容；
①目的基因的獲�。�
用限制酶獲取油菜素內(nèi)酯基因，利用PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增．
②基因表達(dá)載體的構(gòu)建：

 

．
③將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：
先

 

處理細(xì)胞，再將

 

混合培養(yǎng)，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程；最后還需要

 

，篩選成功導(dǎo)入目的基因的菌株．
④目的基因的檢測(cè)與鑒定：
本實(shí)驗(yàn)堆目的基因表達(dá)情況的檢測(cè)與鑒定是

 

水平上的檢測(cè)，具體步驟為：
①將等量篩選過(guò)的菌株分別接種到含農(nóng)藥與不含農(nóng)藥的土壤樣品中培養(yǎng)；
②一段時(shí)間后，分別提取兩個(gè)培養(yǎng)樣品中的受體細(xì)胞，測(cè)定其數(shù)量；
③若

 

，則說(shuō)明油菜素內(nèi)酯基因表達(dá)成功，這樣判斷的原因是

 

．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的原理及技術(shù)

專(zhuān)題：

分析：1、基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（適用于目的基因的核苷酸序列已知的情況）
①概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)．
②原理：DNA復(fù)制
③條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）

解答： 解：（1）PCR技術(shù)中，采用高溫使DNA解旋為單鏈；加入引物與單鏈相互互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，如此循環(huán)．
（2）基因工程的基本操作程序包括4個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定．
①目的基因的獲取：用限制酶獲取油菜素內(nèi)酯基因，利用PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增．
②基因表達(dá)載體的構(gòu)建：用切割目的基因的限制酶來(lái)切割運(yùn)載體，使運(yùn)載體的粘性末端和目的基因的粘性末端相同，用DNA連接酶把目的基因和運(yùn)載體重組到一起，運(yùn)載體上要含有啟動(dòng)子、終止子等．
③將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：先用鈣離子處理細(xì)胞，使細(xì)胞變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合混合培養(yǎng)，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程；最后還需要在添加紅霉素的選擇培養(yǎng)基篩選成功導(dǎo)入目的基因的菌株．
④目的基因的檢測(cè)與鑒定：本實(shí)驗(yàn)題干中目的基因表達(dá)情況的檢測(cè)與鑒定是個(gè)體水平上的檢測(cè)，具體步驟為：
①將等量篩選過(guò)的菌株分別接種到含農(nóng)藥與不含農(nóng)藥的土壤樣品中培養(yǎng)；
②一段時(shí)間后，分別提取兩個(gè)培養(yǎng)樣品中的受體細(xì)胞，測(cè)定其數(shù)量；
③若④環(huán)境生長(zhǎng)的細(xì)胞中的農(nóng)藥殘留量和⑤環(huán)境生長(zhǎng)的細(xì)胞相當(dāng)，則說(shuō)明油菜素內(nèi)酯基因表達(dá)成功，這樣判斷的原因是若油菜素內(nèi)酯基因表達(dá)成功，就能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝，使細(xì)胞內(nèi)的農(nóng)藥殘留轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒無(wú)毒物質(zhì)．
故答案為：
（1）受熱變性  引物 
（2）②用切割目的基因的限制酶來(lái)切割運(yùn)載體，使運(yùn)載體的粘性末端和目的基因的粘性末端相同，用DNA連接酶把目的基因和運(yùn)載體重組到一起，運(yùn)載體上要含有啟動(dòng)子、終止子等．
③用鈣離子   重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞   選擇培養(yǎng)基
④個(gè)體   ④環(huán)境生長(zhǎng)的細(xì)胞中的農(nóng)藥殘留量和⑤環(huán)境生長(zhǎng)的細(xì)胞相當(dāng)   若油菜素內(nèi)酯基因表達(dá)成功，就能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝，使細(xì)胞內(nèi)的農(nóng)藥殘留轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒無(wú)毒物質(zhì)

點(diǎn)評(píng)：本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，只要考生識(shí)記基因工程的操作步驟，明確基因表達(dá)載體的構(gòu)建是其核心步驟，注意單因子變量的設(shè)計(jì)方法，因變量的檢測(cè)方法即可正確答題．