Question

3．如圖表示構(gòu)建均由35S啟動子驅(qū)動的CMO基因與BADH基因的植物雙基因表達載體，圖中標注了相關限制酶的酶切位點，35S表示啟動子及其方向．Nos表示終止子，hpt表示潮霉素抗性基因．請據(jù)圖分析回答：

（1）從功能上分析，35S是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，Nos的功能主要是終止轉(zhuǎn)錄．
（2）過程①應利用SacⅠ、SmaⅠ兩種限制酶切割，酶切后回收載體A的大片段和CMO基因片段，加入含有DNA連接酶的緩沖液，獲得載體C．進而在過程②中，利用HindⅢ、BstEⅡ兩種限制酶切割載體C和載體D，獲得載體E．
（3）利用凍融法將載體E導入農(nóng)桿菌中，制備成菌液LB．將無菌煙草葉片切成0.4cm²大小，加入到菌液LB中浸泡10min，以便充分導入目的基因．用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，注入MS培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入到含有潮霉素的培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)出含載體E的煙草若干株．
（4）利用DNA分子雜交技術檢測發(fā)現(xiàn)呈陽性的煙草植株，再進一步利用抗原-抗體雜交方法檢測到CMO基因與BADH基因均有表達的煙草植株．

Answer 1

分析 基因工程的四個步驟：
①目的基因的獲取：常用的方法有從基因文庫中獲取、逆轉(zhuǎn)錄法、PCR技術擴增、化學合成法等．
②基因表達載體的構(gòu)建：常用同種限制酶切割運載體和目的基因之后，用DNA連接酶連接．一般包括目的基因、標記基因、啟動子和終止子．
③將目的基因?qū)�入受體細胞：植物細胞常用的有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法；動物常用顯微注射法；微生物常用鈣離子處理法．
④目的基因的檢測與表達：分子水平的檢測有DNA分子雜交技術檢測目的基因存在、分子雜交技術檢測是否轉(zhuǎn)錄、抗原抗體雜交技術檢測基因是否表達，還有個體水平的檢測等．

解答 解：（1）分析題干信息可知，從功能上分析，35S是啟動子，啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；Nos表示終止子，因此Nos的功能主要是終止轉(zhuǎn)錄．
（2）分析圖解可知，過程①應利用SacⅠ、SmaⅠ兩種限制酶切割目的基因和載體A，酶切后回收載體A的大片段和CMO基因片段，加入含有DNA連接酶的緩沖液，獲得載體C．在過程②中，要用相同的限制酶切割目的基因和載體C，因此需要利用HindⅢ、BstEⅡ兩種限制酶切割載體C和載體D，獲得載體E．
（3）利用凍融法將載體E導入農(nóng)桿菌中，制備成菌液LB．將無菌煙草葉片切成0.4cm²大小，加入到菌液LB中浸泡10min，以便充分導入目的基因．根據(jù)題意可知，“hpt表示潮霉素抗性基因”，該基因作為運載體上的標記基因，因此培養(yǎng)基中應該加入潮霉素．
（4）利用DNA分子雜交技術檢測發(fā)現(xiàn)呈陽性的煙草植株，再進一步利用抗原-抗體雜交方法檢測到CMO基因與BADH基因均有表達的煙草植株．
故答案為：
（1）RNA聚合酶     終止轉(zhuǎn)錄
（2）SacⅠ、SmaⅠDNA連接     HindⅢ、BstEⅡ
（3）充分導入目的基因     潮霉素
（4）CMO基因與BADH基因

點評 本題主要考查與基因工程相關的知識，要求考生能夠識記基因工程的操作程序，識記基因表達載體的組成；能夠根據(jù)題干和題圖信息確定啟動子和終止子以及標記基因，并選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，再根據(jù)所學知識進行相關判斷．