Question

16．白僵菌可感染農(nóng)業(yè)害蟲，常作為防治害蟲的菌劑．由于白僵菌對(duì)除草劑草丁膦敏感且殺死害蟲的能力較弱，科研人員對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，流程如圖所示．
（1）蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的毒蛋白，能有效殺死害蟲．已知該基因的全部序列，科研人員通過(guò)人工合成（或“化學(xué)合成”）法和PCR技術(shù)獲得大量毒蛋白基因片段．據(jù)圖分析，將毒蛋白基因和質(zhì)粒連接獲得重組質(zhì)粒1的過(guò)程需要用到的工具酶是NcoI、BamHI和DNA連接酶．
（2）重組質(zhì)粒1和Bar基因（草丁膦抗性基因）各自用Xba I 酶處理，得到酶切片段．重組質(zhì)粒1 的酶切片段再用去磷酸化酶處理，使末端游離的磷酸基團(tuán)脫離，目的是防止重組質(zhì)粒1酶切片段自身連接（或“相互連接”）．將未用去磷酸化酶處理的Bar 基因與重組質(zhì)粒1 連接，獲得重組質(zhì)粒2．獲得的重組質(zhì)粒2的是下圖中的C．
（3）將重組質(zhì)粒2與經(jīng)Ca²⁺處理過(guò)的白僵菌菌液混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒 2在白僵菌細(xì)胞內(nèi)被修復(fù)．一段時(shí)間后用含有草丁膦的平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得含有Bar 基因的重組白僵菌．
（4）提取上述重組白僵菌全部mRNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA．在獲得的產(chǎn)物中加入毒蛋白基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，用以檢測(cè)毒蛋白基因是否完成了轉(zhuǎn)錄．
（5）科研人員將重組白僵菌噴涂于植物葉片上，以此飼喂饑餓處理的害蟲，記錄單位時(shí)間內(nèi)的死亡害蟲數(shù)，以判斷重組白僵菌的殺蟲效果．

Answer 1

分析 分析圖解：圖中首先利用NcoI、BamHI兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，然后再用DNA連接酶形成重組質(zhì)粒，利用兩種限制酶可以防止目的基因和質(zhì)粒自身連接；然后再利用XbaI 酶分別切割重組質(zhì)粒1和Bar基因，再構(gòu)建重組質(zhì)粒2．

解答 解：（1）根據(jù)題意可知，已知該基因的全部序列，因此科研人員應(yīng)通過(guò)人工合成（或“化學(xué)合成”）法和PCR技術(shù)獲得大量毒蛋白基因片段．據(jù)圖分析，將毒蛋白基因和質(zhì)粒連接獲得重組質(zhì)粒l的過(guò)程需要用到的工具酶是NcoI、BamHI和DNA連接酶．
（2）利用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因產(chǎn)生的黏性末端相同，這樣容易導(dǎo)致質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化．因此重組質(zhì)粒1和Bar基因各自用XbaI酶處理，得到酶切片段．重組質(zhì)粒l的酶切片段再用去磷酸化酶處理，使端游離的磷酸基團(tuán)脫離，目的是防止重組質(zhì)粒1酶切片段自身連接（或“相互連接”）．如果Bar基因未用去磷酸化酶處理，則形成的黏性末端兩端都存在游離的磷酸集團(tuán)；而重組質(zhì)粒1利用了去磷酸化酶處理，兩端沒(méi)有游離的磷酸集團(tuán)，因此將兩者連接，獲得重組質(zhì)粒2，即兩端都不能完全連接，如圖中的C．
（3）將重組質(zhì)粒2與用鈣離子處理處于感受態(tài)的白僵菌菌液混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒2在白僵菌細(xì)胞內(nèi)被修復(fù)．一段時(shí)間后用含有草丁膦的平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得含有Bar基因的重組白僵菌．
（4）提取上述重組白僵菌全部mRNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA．由于mRNA是通過(guò)轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，合成的cDNA也是特定的DNA，因此再加入毒蛋白基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，用以檢測(cè)毒蛋白基因是否完成了轉(zhuǎn)錄．
（5）科研人員將重組白僵菌噴涂于植物葉片上，以此飼喂饑餓處理的害蟲，記錄單位時(shí)間內(nèi)的死亡害蟲數(shù)，以判斷重組白僵菌的殺蟲效果．
故答案為：
（1）人工合成（或“化學(xué)合成”）     Nco I、BamH I
（2）重組質(zhì)粒1酶切片段自身連接（或“相互連接”）    C
（3）Ca²⁺  草丁膦
（4）逆轉(zhuǎn)錄    轉(zhuǎn)錄
（5）死亡害蟲數(shù)

點(diǎn)評(píng) 本題考查了基因工程的有關(guān)知識(shí)，具有一定的綜合性和難度，要求考生能夠掌握基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程；識(shí)記基因工程的工具酶，并能夠根據(jù)圖示信息進(jìn)行解題．