Question

【題目】骨缺損治療是臨床工作的一大挑戰(zhàn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常用于骨和軟骨的再生，但不適合長期培養(yǎng)�？茖W(xué)家基于CRISPR/Cas9同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制，將永生化癌基因SV40T靶向整合到小鼠Rosa26基因座，建立了永生化的BMSC，使用腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMP-9后可以有效地誘導(dǎo)異位成骨。HDR機(jī)制的原理是：用單個具有引導(dǎo)作用的sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割（圖1），DNA雙鏈發(fā)生斷裂后，在同源模板DNA存在時，通過HDR途徑，根據(jù)模板供體DNA序列在預(yù)定位點(diǎn)精確整合DNA序列（圖2）。回答下列問題：

（1）sgRNA之所以能引導(dǎo)Cas9核酸酶對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，是因為其序列能與小鼠DNA特定位點(diǎn)（靶位點(diǎn)）進(jìn)行____________。據(jù)此分析，需確定靶位點(diǎn)序列在基因組中唯一性的原因是___________________________。

（2）運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)時，可將sgRNA和Cas9mRNA元件導(dǎo)入小鼠的受精卵，使用的方法是____________。還可通過腺病毒將CRISPR系統(tǒng)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，腺病毒能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞，且不會將其DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中，為基因治療設(shè)計的腺病毒應(yīng)具備的特點(diǎn)是_______________________（至少答出兩點(diǎn)）。

（3）可提取小鼠的基因組DNA作為模板，利用PCR技術(shù)檢測SV40T基因是否成功整合到小鼠Rosa26基因座中。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時應(yīng)使用____________種引物，需要合成引物的原因是__________________。

Answer 1

【答案】堿基互補(bǔ)配對 防止基因組中存在一段以上能與sgRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的序列，從而避免其他基因被破壞 顯微注射法 具有標(biāo)記基因；有一個或多個限制酶的識別和切割位點(diǎn) 兩 Taq 酶只能聚合單個脫氧核苷酸到已有的核苷酸鏈上，不能從頭合成DNA

【解析】

基因工程的基本內(nèi)容包括：（1）外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究；（2）適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；（3）外源基因的導(dǎo)入；（4）外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。

根據(jù)題意分析可知，sgRNA能引導(dǎo)Cas9核酸酶對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，圖1,2所示為基因工程中構(gòu)建目的基因的步驟。

（1）sgRNA之所以能引導(dǎo)Cas9核酸酶對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，是因為其序列能與小鼠DNA特定位點(diǎn)（靶位點(diǎn)）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。需確定靶位點(diǎn)序列在基因組中唯一性的原因是防止基因組中存在一段以上能與sgRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的序列，從而破壞其他基因。

（2）將sgRNA和Cas9mRNA元件導(dǎo)入小鼠的受精卵，使用的方法是顯微注射法。通過腺病毒將CRISPR系統(tǒng)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，為基因治療設(shè)計的腺病毒應(yīng)具備的特點(diǎn)是具有自我復(fù)制能力、具有標(biāo)記基因、有一個或多個限制酶的識別和切割位點(diǎn)。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時應(yīng)使用兩種引物，需要合成引物的原因是Taq酶不能從頭合成DNA，只能聚合單個脫氧核苷酸到已有的核苷酸鏈上。