Question

【題目】海洋石油污染正引起光泛關(guān)注。利用基因工程菌進(jìn)行生物降解具有巨大的應(yīng)用潛力。P450是石油降解的關(guān)鍵酶，用Sal I和NdeI聯(lián)合酶切獲得的P450基因，與甲圖所示的質(zhì)粒pCom8重組，導(dǎo)入土著石油降解菌種Y9，獲得了基因工程菌中mel是黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素（一種抗生素）抗性基因，限制酶NdeI、XhoI和SspI在原質(zhì)粒上均只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，數(shù)字表示酶切位點(diǎn)間的堿基對(duì)數(shù)，乙圖表示幾種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。

(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要使用限制酶和_____酶。圖乙所示的幾種限制酶中，切割目的基因產(chǎn)生平末端的是_______。

(2)質(zhì)粒pCom8需用限制酶_____作用后，才能與P450基因形成重組質(zhì)粒：為了便于重組質(zhì)粒的導(dǎo)入，常使用_____處理Y9細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。若對(duì)重組質(zhì)粒再次使用上述限制酶切制，可獲得_____個(gè)DNA片段。

(3)經(jīng)測(cè)定原質(zhì)粒為7.6kb(1kb為1000個(gè)堿基對(duì))，重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI.SspI聯(lián)合酶切后獲得了6.0kb和1.2kb的兩個(gè)片段，則目的基因的長(zhǎng)度為______kb。

(4)由于重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的成功率很低，所以需要經(jīng)過篩選才能獲得工程菌。操作的大致思路是：

第一步，配制培養(yǎng)基。除下表中的成分外，還必須添加瓊脂和_____。

蛋白胨	酵母侵膏	NaCl	KCl	MgCl2	H2O	pH
20g	5.0g	0.5g	0.2g	1.0g	1000ml	7.0

第二步，將待檢菌液接種在第一步配制的培養(yǎng)基上。

第三步，選擇_____色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)即可獲得所需的工程菌。

Answer 1

【答案】DNA連接(酶) SspI Nde1、XhoI Ca2＋ I 1.4 慶大霉素 白

【解析】

據(jù)圖分析，圖示為質(zhì)粒和相關(guān)限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)，甲圖質(zhì)粒中有限制酶NdeⅠ、XhoⅠ和SspⅠ的切割位點(diǎn)，且NdeⅠ與另外兩種限制酶之間的堿基對(duì)數(shù)分別為1.8kb、1.2kb；從圖中能看出SspⅠ破壞了標(biāo)記基因aacCl。

（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要使用限制酶將質(zhì)粒和目的基因切出相同的黏性末端并用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接在一起。由圖可知，圖乙所示的幾種限制酶中，切割目的基因產(chǎn)生平末端的是SspI。

（2）根據(jù)題干信息已知，切割P450基因的限制酶是SalI和NdeI聯(lián)合酶，而甲圖質(zhì)粒上沒有SalⅠ酶的酶切位點(diǎn)，所以切割質(zhì)粒時(shí)可用乙圖中的XhoI酶代替，二者作用后可形成相同的黏性末端。所以質(zhì)粒pCom8需用限制酶Nde1、XhoI作用后，再與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒。為了便于重組質(zhì)粒的導(dǎo)入，常使用Ca2＋處理Y9細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。若對(duì)重組質(zhì)粒再次使用上述限制酶切制，由于只有NdeI酶可識(shí)別其切割位點(diǎn)，所以可獲得1個(gè)線性DNA片段。

（3）據(jù)圖分析，用NdeⅠ、XhoⅠ切割質(zhì)粒后質(zhì)粒的長(zhǎng)度部位7.6-1.8=5.8kb，而重組質(zhì)粒長(zhǎng)度=6.0+1.2=7.2kb，因此目的基因的長(zhǎng)度=7.2-5.8=1.4kb。

（4）重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的成功率很低，大多數(shù)質(zhì)粒是空白質(zhì)粒，沒有目的基因，因此需要經(jīng)過篩選才能獲得工程菌：第一步，配制培養(yǎng)基，表格中的成分有碳源、氮源、水和無(wú)機(jī)鹽，由于重組質(zhì)粒上含有標(biāo)記基因，且選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，因此培養(yǎng)基中還必須添加瓊脂和慶大霉素。
第二步，將待檢菌液用稀釋涂布平板法接種在第一步配制的培養(yǎng)基上。
第三步，甲圖中mel是黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的菌落變成黑色，而該基因已經(jīng)被限制酶切割和破壞了，因此應(yīng)該選擇白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)即可獲得所需的工程菌。