Question

14．透明質(zhì)酸酶臨床常用作藥物滲透劑，目前市場上出售的透明質(zhì)酸酶主要從動物組織中提取，成本高且提純困難．科研人員嘗試將透明質(zhì)酸酶基因（Hyl）高效表達(dá)；重疊延伸PCR是一種定點(diǎn)突變技術(shù)，主要設(shè)計思路是用具有互補(bǔ)配對片段的引物，進(jìn)行PCR1和PCR2獲得部分重疊的兩種 DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊部分的互補(bǔ)和延伸獲得目的基因．其過程如圖所示，Nco I和XhoI為限制酶識別位點(diǎn)．請分析回答下列有關(guān)問題：

（1）步驟②中所用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶，NcoⅠ切割磷酸二酯鍵．
（2）步驟①進(jìn)行定點(diǎn)突變的目的是防止限制酶（NcoI）破壞目的基因，將透明質(zhì)酸酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌使其高效表達(dá)，利用了大腸桿菌的繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少特點(diǎn)，導(dǎo)入大腸桿菌時，首先要用Ca²⁺處理．
（3）在利用重疊延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變時需要如圖所示四種引物，若PCR1所用引物為引物1和引物3，則PCR2時B 點(diǎn)所選用的引物是圖中的引物4，如果突變后的透明質(zhì)酸酶基因進(jìn)行PCR，所選的引物為引物1和引物2．
（4）谷丙轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是長期用于病毒性肝炎患者肝功能的檢測指標(biāo)．最近，研究者提出檢測空腹血清透明質(zhì)酸酶水平了解肝硬化患者的肝損害程度，請分析其機(jī)理．正常情況下，透明質(zhì)酸酶在細(xì)胞中存在，血清透明質(zhì)酸酶高，說明肝細(xì)胞壞死增多．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）步驟②表示基因表達(dá)載體得到構(gòu)建，該過程中首先需要利用同種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，再利用DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒，限制酶切割的是磷酸二酯鍵．
（2）分析圖解可知，圖中目的基因的中間存在NcoⅠ限制酶的切割位點(diǎn)，因此步驟①進(jìn)行定點(diǎn)突變是為了防止限制酶（NcoI）破壞目的基因；由于大腸桿菌具有繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少特點(diǎn)，因此常作為基因工程的受體細(xì)胞，并且目的基因?qū)�入大腸桿菌時，首先要用Ca²⁺處理，使其成為感受態(tài)細(xì)胞．
（3）在利用重疊延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變時需要如圖所示四種引物，若PCR1所用引物為引物1和引物3，則PCR2時B點(diǎn)所選用的引物是圖中的引物4，如果突變后的透明質(zhì)酸酶基因進(jìn)行PCR，所選的引物為引物1和引物2．
（4）正常情況下，透明質(zhì)酸酶在細(xì)胞中存在，血清透明質(zhì)酸酶高，說明肝細(xì)胞壞死增多，因此可以通過檢測空腹血清透明質(zhì)酸酶水平了解肝硬化患者的肝損害程度．
故答案為：
（1）限制酶和DNA 連接酶      磷酸二酯鍵
（2）防止限制酶（Nco I ）破壞目的基因   繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少   Ca²⁺
（3）引物4   引物1 和引物2
（4）正常情況下，透明質(zhì)酸酶在細(xì)胞中存在，血清透明質(zhì)酸酶高，說明肝細(xì)胞壞死增多

點(diǎn)評 本題考查了基因工程的有關(guān)知識，要求考生能夠掌握基因工程的工具以及工具酶的作用部位，掌握基因工程的原理和操作步驟，掌握PCR技術(shù)定點(diǎn)誘變的原理，再結(jié)合所學(xué)知識準(zhǔn)確答題．