Question

17．GDNF是一種神經營養(yǎng)因子，對損傷的神經細胞具有營養(yǎng)和保護作用，研究人員構建了GDNF基因的表達載體（如圖1所示），并導入到大鼠神經干細胞中，用于于細胞基因治療的研究，請回答：

（1）在分離和培養(yǎng)大鼠神經干細胞的過程中，使用胰蛋白酶的目的是使細胞分散開；
（2）構建含GCDNF基因的表達載體時，需選擇圖1中的XhoⅠ限制酶進行酶切．
（3）經酶切后的載體和GDNF基因進行連接，連接產物經篩選得到的載體主要有3種：單個載體自連、CDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）為鑒定這3種連接方式，選擇HpaⅠ酶和BamⅡ酶對篩選得到的載體進行雙酶切，并對酶切后的DNA片透進行電泳分析，結果如圖2所示，圖中第②泳道顯示所鑒定的載體是正向連接的．
（4）將正向連接的表達載體導入神經干細胞后，為了檢測GDNF基因是否成功表達，可用相應的抗體與提取的蛋白質雜交，當培養(yǎng)的神經干細胞達到一定密度時，需進行傳代培養(yǎng)以得到更多數量的細胞，用于細胞干細胞移植治療實驗．

Answer 1

分析 1、基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、動物細胞培養(yǎng)的過程：取動物組織塊→剪碎組織→用胰蛋白酶處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養(yǎng)液中（原代培養(yǎng)）→放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞用酶分散為單個細胞，制成細胞懸液→轉入培養(yǎng)液（傳代培養(yǎng)）→放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)．

解答 解：（1）胰蛋白酶的作用是消化組織細胞間的物質，使組織分散成單個細胞．
（2）根據題意和圖示分析可知：由于GDNF基因兩邊都有XhoⅠ限制酶識別序列，所以構建含GCDNF基因的表達載體時，需選擇圖1中的XhoⅠ限制酶進行酶切．
（3）選擇HpaⅠ酶和BamⅡ酶對篩選得到的載體進行雙酶切，并對酶切后的DNA片透進行電泳分析，結果如圖2所示，由于GDNF基因中有BamⅡ酶識別序列，所以圖中第②泳道顯示所鑒定的載體是正向連接的．
（4）為了檢測GDNF基因是否成功表達，可利用抗原-抗體雜交技術，用相應的抗體與提取的蛋白質雜交，當培養(yǎng)的神經干細胞達到一定密度時，需進行傳代培養(yǎng)以得到更多數量的細胞，用于細胞干細胞移植治療實驗．
故答案為：
（1）使細胞分散開
（2）XhoⅠ
（3）②
（4）抗體    傳代

點評 本題考查基因工程、動物細胞培養(yǎng)的相關知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟等，掌握各步驟中的相關細節(jié)，能結合所學的知識準確判斷各選項．